PCR, mao ang polymerase chain reaction, nga nagtumong sa pagdugang sa dNTP, Mg2+, elongation factors ug amplification enhancement factors ngadto sa sistema ubos sa catalysis sa DNA polymerase, gamit ang parent DNA isip template ug piho nga primers isip sinugdanan sa extension , Pinaagi sa mga lakang sa denaturation, annealing, extension, ug uban pa, ang proseso sa in vitro nga pagkopya sa anak nga babaye nga strand nga DNA nga komplementaryo sa parent strand template DNA mahimong dali ug espesipikong makapadako sa bisan unsang target nga DNA sa vitro.
1. Hot Start PCR
Ang oras sa pagsugod sa pagpadako sa naandan nga PCR dili ang pagbutang sa PCR machine sa PCR machine, ug dayon ang programa magsugod sa pagpadako.Kung nahuman na ang pagsumpo sa sistema, magsugod ang pagpadako, nga mahimong hinungdan sa dili piho nga pagpadako, ug ang init nga pagsugod sa PCR makasulbad niini nga problema.
Unsa ang init nga pagsugod sa PCR?Human maandam ang sistema sa reaksyon, ang enzyme modifier gibuhian sa taas nga temperatura (kasagaran mas taas kay sa 90 ° C) atol sa inisyal nga yugto sa pagpainit sa reaksyon o "init nga pagsugod" nga yugto, aron ang DNA polymerase ma-activate.Ang eksakto nga oras sa pagpaaktibo ug temperatura nagdepende sa kinaiya sa DNA polymerase ug ang hot-start modifier.Kini nga pamaagi nag-una nga naggamit sa mga modifier sama sa mga antibodies, affinity ligand, o kemikal nga mga modifier aron pugngan ang kalihokan sa DNA polymerase.Tungod kay ang kalihokan sa DNA polymerase gipugngan sa temperatura sa lawak, ang init nga pagsugod nga teknolohiya naghatag ug dakong kasayon alang sa pag-andam sa daghang mga sistema sa reaksyon sa PCR sa temperatura sa lawak nga dili isakripisyo ang espesipiko sa mga reaksiyon sa PCR.
2. RT-PCR
Ang RT-PCR (Reverse transcription PCR) usa ka eksperimento nga teknik para sa reverse transcription gikan sa mRNA ngadto sa cDNA ug gigamit kini isip template para sa amplification.Ang eksperimento nga pamaagi mao ang pagkuha sa kinatibuk-ang RNA sa mga tisyu o mga selula una, gamita ang Oligo (dT) isip primer, gamita ang reverse transcriptase aron ma-synthesize ang cDNA, ug dayon gamiton ang cDNA isip template alang sa PCR amplification aron makuha ang target nga gene o ma-detect ang gene expression.
3. Fluorescent quantitative PCR
Fluorescent quantitative PCR (Real-time nga Quantitative PCR,RT-qPCR) nagtumong sa pamaagi sa pagdugang sa fluorescent nga mga grupo sa PCR reaction system, gamit ang accumulation sa fluorescent signals aron mamonitor ang tibuok proseso sa PCR sa tinuod nga panahon, ug sa kataposan gamit ang standard curve para quantitatively analyze ang template.Ang kasagarang gigamit nga mga pamaagi sa qPCR naglakip sa SYBR Green I ug TaqMan.
4. Nested PCR
Ang nested PCR nagtumong sa paggamit sa duha ka set sa PCR primer para sa duha ka hugna sa PCR amplification, ug ang produkto sa amplification sa ikaduhang hugna mao ang target gene fragment.
Kung ang usa ka mismatch sa unang parisan sa primers (outer primers) hinungdan sa usa ka non-specific nga produkto nga mapadako, ang posibilidad sa parehas nga non-specific nga rehiyon nga mailhan sa ikaduhang parisan sa mga primers ug nagpadayon sa pagpadako gamay kaayo, busa ang amplification pinaagi sa ikaduhang parisan sa primers, ang specificity sa PCR milambo.Usa ka bentaha sa paghimo sa duha ka hugna sa PCR mao nga kini makatabang sa pagpadako sa igo nga produkto gikan sa limitado nga pagsugod sa DNA.
5. Touchdown PCR
Ang Touchdown PCR usa ka pamaagi aron mapauswag ang pagka-espesipiko sa reaksyon sa PCR pinaagi sa pag-adjust sa mga parameter sa siklo sa PCR.
Sa touchdown PCR, ang annealing temperature para sa unang pipila ka cycle gitakda ug pipila ka degrees labaw sa maximum annealing temperature (Tm) sa mga primer.Ang mas taas nga temperatura sa annealing epektibo nga makapakunhod sa dili piho nga pagpadako, apan sa samang higayon, ang mas taas nga temperatura sa annealing makapasamot sa pagbulag sa mga primer ug target nga han-ay, nga moresulta sa pagkunhod sa ani sa PCR.Busa, sa unang pipila ka mga cycle, ang annealing temperature kasagarang gitakda nga mokunhod sa 1°C kada siklo aron madugangan ang sulod sa target nga gene sa sistema.Kung ang temperatura sa annealing gipaubos sa labing taas nga temperatura, ang temperatura sa annealing gipadayon alang sa nahabilin nga mga siklo.
6. Direktang PCR
Ang direkta nga PCR nagtumong sa pagpadako sa target nga DNA direkta gikan sa sample nga wala kinahanglana ang pag-inusara ug pagputli sa nucleic acid.
Adunay duha ka matang sa direktang PCR:
direkta nga pamaagi: pagkuha og gamay nga sample ug idugang kini direkta sa PCR Master Mix para sa PCR identification;
pamaagi sa pag-crack: human sa pag-sample sa sample, idugang kini sa lysate, lyse aron buhian ang genome, pagkuha og gamay nga kantidad sa lysed supernatant ug idugang kini sa PCR Master Mix, paghimo sa PCR identification.Kini nga pamaagi nagpasimple sa eksperimento nga dagan sa trabaho, nagpamenos sa mga hands-on nga oras, ug naglikay sa pagkawala sa DNA sa mga lakang sa pagputli.
7. SOE PCR
Ang gene splicing pinaagi sa overlap extension PCR (SOE PCR) naggamit sa mga primer nga adunay komplementaryong mga tumoy aron ang mga produkto sa PCR maporma nga nagsapaw-sapaw nga mga kadena, aron nga sa sunod nga amplification reaction, pinaagi sa pagpalapad sa nagsapaw-sapaw nga mga kadena, lain-laing mga tinubdan sa Usa ka teknik diin ang mga gipadako nga mga tipik gisapawan. ug gidugtong.Kini nga teknolohiya sa pagkakaron adunay duha ka nag-unang direksyon sa aplikasyon: pagtukod sa fusion genes;mutation nga gitumong sa gene site.
8. IPCR
Ang Inverse PCR (IPCR) naggamit ug reverse complementary primers aron sa pagpadako sa mga tipik sa DNA gawas sa duha ka primer, ug pagpadako sa wala mailhi nga mga han-ay sa duha ka kilid sa nailhan nga tipik sa DNA.
Ang IPCR orihinal nga gidisenyo aron mahibal-an ang han-ay sa kasikbit nga wala mailhi nga mga rehiyon, ug kasagaran gigamit sa pagtuon sa mga han-ay sa tigpasiugda sa gene;oncogenic chromosomal rearrangements, sama sa gene fusion, translocation ug transposition;ug viral gene integration, kay kasagarang gigamit karon Para sa site-directed mutagenesis, kopyaha ang plasmid nga adunay gusto nga mutation.
9. dPCR
Ang Digital PCR (dPCR) usa ka teknik alang sa hingpit nga pag-ihap sa mga molekula sa nucleic acid.
Sa pagkakaron adunay tulo ka mga pamaagi alang sa pag-ihap sa mga molekula sa nucleic acid.Ang photometry gibase sa pagsuyop sa mga molekula sa nucleic acid;Ang real-time nga fluorescent quantitative PCR (Real Time PCR) gibase sa Ct value, ug ang Ct value nagtumong sa cycle number nga katumbas sa fluorescence value nga mahimong mamatikdan;Ang digital PCR mao ang pinakabag-o nga Quantitative nga teknolohiya base sa single-molecule PCR method para sa pag-ihap sa nucleic acid quantification kay usa ka absolute quantitative method.
Oras sa pag-post: Hun-13-2023